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Please use this identifier to cite or link to this item: http://ntour.ntou.edu.tw:8080/ir/handle/987654321/30295

Title: Aeromonas salmonicida MAEF 108 所產鹿角菜膠酶基因轉殖至Lactococcus lactis NZ3900中表現之探討
The Study of Cloning and Expression of Carrageenase gene on Lactoccus latis NZ3900 that devived from Aeromonas salmonicida MAEF 108
Authors: 朱家宏
Contributors: NTOU:Department of Food Science
國立臺灣海洋大學:食品科學系
Keywords: Lactcoccus lactis NZ3900;NICE 系統;鹿角菜膠;鹿角菜膠酶
Lactcoccus lactis NZ3900;Nisin Controlled Expression system;Carrageenan;Carrageenase
Date: 2011
Issue Date: 2011-11-25T07:38:12Z
Abstract: 本研究在於探討將 Aeromonas salmonicida MAEF 108 Carrageenase基因 carI 利用 TA cloning 轉形至大腸桿菌中,再利用轉形成功之大腸桿菌轉殖株以限制酶選殖方式轉形至乳酸菌中,並測試乳酸菌轉殖株NZ3900-carI 之菌株質體穩定性、Nisin 耐受性、Nisin 誘導 carI表現、及其所產 Carrageenase 之活性變化。將carI 基因引子對分別於 5,加入限制酶 KpnI 切位及3,加入限制酶 sacI 切位,並以聚合酶反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 擴增菌株 MAEF 108 染色體中carI 基因之 DNA 片段,將推論所得之 carI 基因之 DNA 片段經 A-tailing 處理後,再與 pGEM-TTM 載體 (amp+)組合成為重組載體I ,並於洋菜糖膠電泳片上之 4 kb 處確認重組載體I。重組載體I 經熱休克轉形至 E. coli DH5勝任細胞後,共篩得 17 株 amp+ 轉殖株,挑選一株轉殖株之重組載體I 經 PCR 擴增及限制酶剪切後,於洋菜糖膠電泳片上之 1 kb 處初步確認為 carI 基因之 DNA 片段。大腸桿菌轉殖株之重組載體I 及乳酸菌載體 pNZ8149皆以限制酶 (SacI 和 KpnI) 剪切後,利用連接反應組合成為重組載體II,重組載體II 以電穿孔法轉形至 Lactococcus lactis NZ3900。乳酸菌轉殖株利用 100oC沸水破細胞後,經 PCR 擴增後即可於洋菜糖膠電泳片上之 1 kb 處初步確認 carI基因片段,篩得 2 株 lac+ 轉殖株,並自乳酸菌轉殖株抽取質體與經限制酶剪切以及利用洋菜糖膠電泳進一步確認為 carI 基因之DNA。取乳酸菌轉殖株 NZ3900-carI 之重組載體II carI 基因片段進行定序,再與菌株 MAEF 108 carI 基因之原始序列作比對後,發現只有 4 個鹼基對有異。乳酸菌轉殖株 NZ3900-carI 於 M17G 和M17L 培養液中分別連續轉接 3 次,其質體穩定度分別為 80% 和 87%。轉殖株 NZ3900-carI之Nisin 耐受性方面,當轉殖株NZ3900-carI 在 Nisin 濃度大於或等於 100 ng/mL 培養液培養時,其生長會受到抑制。將 轉殖株NZ3900-carI 培養於 Nisin 濃度為 5 ng/mL 於 40oC下培養10 hr 可獲得最佳被誘導酵素活性,其 Carrageenase 之比活性為 0.0323 U/mg。以轉殖株NZ3900-carI 超音波破細胞之最佳處理條件為功率 15 W、破碎時間 5 min、超音波作用時間 3 sec 和休息時間 6 sec、菌量濃度 0.033 g/mL (溼重)。胞內粗酵素液之為最適溫度及 pH 值分別是 40oC 及 pH 7.0。將轉殖株NZ3900-carI 之胞內粗酵素液放於 pH 7.2 之緩衝溶液中存放於4-50 oC 下 2 hr,其 Carrageenase 相對活性皆有85% 以上。pH 值穩定性保存於 4oC 下 2 hr 只有 pH 7.0 和8.0 測得到活性,由此可知 Carrageenase 對 pH 值較為敏感。測試之金屬離子中Sn2+ 和 Zn2+ 可將 Carrageenase 之相對酵素活性分別提升至 138.68% 和137.56%,而金屬離子中之 Ba2+ 和 Mn2+ 可完全抑制 Carrageenase 活性。
URI: http://ethesys.lib.ntou.edu.tw/cdrfb3/record/#G0M98320051
http://ntour.ntou.edu.tw/handle/987654321/30295
Appears in Collections:[食品科學系] 博碩士論文

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