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Please use this identifier to cite or link to this item: http://ntour.ntou.edu.tw:8080/ir/handle/987654321/17027

Title: pkd2基因弱化對斑馬魚 (Danio rerio) 胚胎腎臟、心臟發育及水腫生成之影響
The impacts of pkd2 gene knockdown on kidney, heart development and edema in zebrafish (Danio rerio)
Authors: Chia-Hsian Fan
范家銑
Contributors: NTOU:Department of Aquaculture
國立臺灣海洋大學:水產養殖學系
Keywords: 腎臟;心臟;水腫;多囊腎
kidney;heart;edema;polycystic kidney disease
Date: 2009
Issue Date: 2011-06-30T08:47:44Z
Abstract: Polycystin-2為細胞膜上可通透鈣離子之陽離子通道,由pkd2基因轉譯而成。在臨床醫學上發現當pkd2 基因發生突變會導致人類先天性遺傳疾病多囊性腎病 (autosomal dominate polycystic kidney disease, ADPKD),造成患者腎臟產生囊腫,嚴重者會導致腎衰竭進而死亡。本研究是利用斑馬魚 (Danio rerio) 作為實驗動物,研究pkd2 基因缺損對斑馬魚胚胎腎臟與心臟發育之影響。以半定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (semi-quantitative RT-PCR) 分析斑馬魚pkd2 基因在不同胚胎發育時期之表現情形,發現pkd2 基因在斑馬魚胚胎在1-細胞期已有表現,而在8hpf 至12hpf 表現量上升,其餘各時期表現量皆維持穩定直到48hpf。以RNA全覆式原位雜交 (RNA whole-mount in situ hybridization) 偵測斑馬魚pkd2 基因在斑馬魚胚胎12hpf 時開始廣泛表現於胚胎的全身,在16hpf 與30hpf 可觀察到pkd2 基因在胚胎頭部及軀幹均有表現,且多集中表現於頭部。40hpf、48hpf 及72hpf 可觀察到 pkd2 基因除了在頭部及軀幹有表現外在胚胎腎管也可偵測到pkd2 mRNA。利用專一性反意股寡核酸抑制pkd2基因的表現後,由組織切片可觀察到胚胎出現腎管囊腫。胚胎外觀上則出現包括腦水腫、心包膜水腫、腹部水腫以及軀幹彎曲等現象。進一步可觀察到胚胎心臟產生缺損且胚胎存活率降低。利用半定量RT-PCR 偵測pkd2 基因弱化胚胎的心臟發育相關標誌基因cmlc2、amhc、vmhc 及tbx5 mRNA 表現情形,結果顯示在24hpf、30hpf 及48hpf 胚胎之cmlc2、amhc、vmhc 及tbx5 mRNA 表現量均有顯著下降,顯示pkd2 基因弱化直接或間接影響心臟生成與發育。在腎臟功能測試實驗中,於斑馬魚胚胎48hpf、72hpf、96hpf 及120hpf 注射10 kD dextran-rhodamine 觀察到pkd2 基因弱化後72hpf、96hpf 及120hpf 胚胎體內螢光量有累積的現象。在改變體外滲透壓實驗中,將pkd2 基因弱化之胚胎在48hpf 由胚胎培養液中改浸泡入125 mOsm/L 或350 mOsm/L 濃度蔗糖溶液中,24 小時後發現浸泡125 mOsm/L 蔗糖溶液之胚胎水腫情形並無明顯改變。浸泡350 mOsm/L 蔗糖溶液之胚胎水腫現象則有輕微減少,但無法完全消除。以原子吸光儀測定胚胎體內離子含量實驗中,偵測到pkd2 基因弱化之胚胎魚體內鈉離子含量有顯著上升之現象。本研究結果亦證明pkd2 基因弱化後可導致斑馬魚胚胎腎臟衰竭,進而引發心臟異常及心腎綜合症 (cardiorenal symdrom)。而本研究結果亦顯示pkd2 基因弱化後所造成斑馬魚胚胎全身性不可逆性胚胎水腫現象可能是經由四種因素相包括:心臟發育缺損、腎臟功能受損、胚胎滲透壓失調及胚胎體內鈉離子失衡互作用所生成的結果。以斑馬魚DNA 晶片偵測pkd2 基因弱化後斑馬魚胚胎在48hpf 基因表現情形,本研究總共篩選43663 個基因,其中14309 個基因為有效基因,在有效基因中共挑選出了217 個基因表現量上升兩倍以上,112 個基因表現量被抑制兩倍以下。透過此一結果可了解pkd2 基因弱化後其他基因表現可能調控機制與作用路徑,做為日後找尋腎病生成原因之依據。本研究證明以斑馬魚建立pkd2 基因弱化及慢性腎臟衰竭模式的可行性。將來可應用於pkd2 基因與腎臟疾病之相關研究。
URI: http://ethesys.lib.ntou.edu.tw/cdrfb3/record/#G0M96330003
http://ntour.ntou.edu.tw/ir/handle/987654321/17027
Appears in Collections:[水產養殖學系] 博碩士論文

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