English  |  正體中文  |  简体中文  |  Items with full text/Total items : 27533/39387
Visitors : 2541892      Online Users : 35
RC Version 4.0 © Powered By DSPACE, MIT. Enhanced by NTU Library IR team.
Scope Adv. Search
LoginUploadHelpAboutAdminister

Please use this identifier to cite or link to this item: http://ntour.ntou.edu.tw:8080/ir/handle/987654321/15983

Title: Pseudomonas vesicularis MA103 所產 Alginate lyase pal III 之基因轉殖至大腸桿菌中表現之探討
Studies on Gene Cloning and Expression of Pseudomonas vesicularis MA103 Alginate Lyase palIII in Escherichia coli
Authors: Hui-Jei Lin
林慧傑
Contributors: NTOU:Department of Food Science
國立臺灣海洋大學:食品科學系
Keywords: 褐藻膠裂解酶 pal III;無限制酶基因選殖法
Date: 2010
Issue Date: 2011-06-30T08:26:56Z
Abstract:   本研究探討 Pseudomonas vesicularis MA103 經誘導產生褐藻膠 裂解酶 (Alginate lyase) 的純化,及藉 N 端胺基酸定序結果比對, 確認該 Alginate lyase 之完整基因序列;由已知的菌株 MA103 基因 體序列中挑選一 Alginate lyase pal III 基因,以無限制酶基因選殖法 (Restriction-free, RF cloning) 轉殖至大腸桿菌中,並觀察其 Alginate lyase rpal III 之酵素活性。以含有 0.2% Sodium alginate 的 Marine broth (MB) 和 Modified marine broth 2-alginate lyase (MMB2-Al) 培養基進行誘導 培養,可有效提高菌株 MA103 crude alginate lyases 的活性,經活性染色和 SDS-PAGE 確認誘導培養可產生兩個 Alginate lyase,由膠片結果推估其分子量大小分別約為 57 和 38 kDa。其粗酵素液以 DE-52 離子交換樹脂層析初步純化,可分離出兩個具有 Alginate lyase 活性的蛋白質波峰,個別收集後命名為 Pv-Al-1 及 Pv-Al-2,其比活性分別為 1142.22 U/mg 和 531.76 U/mg。以 12% SDS-PAGE 分析後得知,Pv-Al-1 與 Pv-Al-2 中仍有部分雜蛋白,需進一步以膠體過濾層析管柱純化;另一方面,從已完成定序的MA103 genomic DNA 中得知有 4 個可能產生 Alginate lyase 的基因片段, 挑選一段核苷酸序列全長為 1041 bp 之 Alginate lyase pal III,可轉譯出 348 個胺基酸,使用 pET 表現系統以及 RF cloning 方法設計兩組引子對,並以 PCR 製得插入 Alginate lyase pal III 基因之重組載體 pET-21b (+) 的 PCR 擴充產物,核苷酸序列全長約為 6500 bp,該 重組載體經電穿孔法轉殖至 E. coli BL21 (DE3) 後,將其載體上之 插入序列定序,其定序結果顯示 rpal III 與 pal III 除了因設計方便 後續純化而剔除的 stop codon 之外,其餘的序列皆相同。經 Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.5 mM) 於 20oC 下 誘導 3 小時後,胞內粗酵素液可得到最高酵素活性 (21.06 U/mg protein),該胞內粗酵素液經由鎳親和性管柱層析處理後,得到純化之 Alginate lyase rpal III (487.50 U/mg protein),此純化酵素液之 SDS-PAGE 結果顯示,其分子量約為 40.5 kDa,與 rpal III 基因序列所推估的大小相似;在基質特異性方面 Alginate lyase rpal III 對於 Alginic acid 具有較高的酵素活性 12.41 U/mL。此外,除了對重緣葉馬尾藻熱萃液約略具有酵素活性 (0.43 U/mL) 外,對於其他的藻類熱萃液則無顯著的酵素活性產生。從 TLC 的分析中得知,Alginate lyase rpal III 在 25oC 與 pH 9.0 中將 Alginate 水解 24小時後所得到的褐藻膠寡醣,與 Zhang et al. (2005) 所發表的文獻數據相比對,推測其水解產物的聚合度 (Degree of polymerization, DP) 可能為 DP4 或 DP5 的褐藻膠寡醣; 而以 MA103 crude alginate lyase 在相同條件下將Alginate水解 24 小時,觀察到四種不同的褐藻膠寡醣產生,其聚合度可能在 DP4-DP8 之間。而從 HPLC 的分析結果得知 Alginate lyase rpal III 與 MA103 crude alginate lyase 在水解 Alginate 24 小時後,分別可能得到兩種和四種褐藻膠寡醣水解產物。未來會進一步將該褐藻膠寡醣分離純化後,再以 NMR 鑑定其褐藻膠寡醣的結構。
URI: http://ethesys.lib.ntou.edu.tw/cdrfb3/record/#G0M97320035
http://ntour.ntou.edu.tw/ir/handle/987654321/15983
Appears in Collections:[食品科學系] 博碩士論文

Files in This Item:

File Description SizeFormat
index.html0KbHTML256View/Open


All items in NTOUR are protected by copyright, with all rights reserved.

 


著作權政策宣告: 本網站之內容為國立臺灣海洋大學所收錄之機構典藏,無償提供學術研究與公眾教育等公益性使用,請合理使用本網站之內容,以尊重著作權人之權益。
網站維護: 海大圖資處 圖書系統組
DSpace Software Copyright © 2002-2004  MIT &  Hewlett-Packard  /   Enhanced by   NTU Library IR team Copyright ©   - Feedback